پایان نامه:طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از واکسن سیاه سرفه
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از واکسن سیاه سرفه
استاد راهنما:
جناب آقای دکتر عبدالرضا موحدی
اساتید مشاور:
جناب آقای دکتر اسماعیل اصلی
جناب آقای دکتر حسین عطار
سال تحصیلی ۹۲-۱۳۹۱
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
خلاصه فارسی ۱
فصل اول: کلیات
۱-۱٫ بیان مسئله ۳
۱-۲٫ تاریخچه بیماری سیاه سرفه . ۴
۱-۳٫ باکتریولوژی. ۷
۱-۴٫ ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه ۱۰
۱-۴-۱٫ توکسین پرتوسیس ۱۰
۱-۴-۲٫ فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA) 12
۱-۴-۳٫ فیمبریه و آگلوتینین ها. ۱۳
۱-۴-۴٫ پرتکتین ۱۵
۱-۴-۵٫ آدنیلات سیکلاز (ACT). 16
۱-۴-۶٫ تراکئال سایتو توکسین (TCT). 17
۱-۴-۷٫ توکسین حساس به حرارت. ۱۸
۱-۴-۸٫ BrKA 18
۱-۴-۹٫ اندوتوکسین. ۱۹
۱-۵٫ سویه های بوردتلا پرتوسیس ۱۹
۱-۶٫ اپیدمیولوژی . ۲۰
۱-۶-۱٫ وضعیت بیماری در ایران ۲۱
۱-۷٫ بیماری زایی سیاه سرفه . ۲۱
۱-۸٫ علائم کلینیکی . ۲۲
۱-۹٫ تشخیص بیماری . ۲۳
۱-۹-۱٫ تشخیص بالینی ۲۳
۱-۹-۲٫ علائم کلینیکی در نوزادان. ۲۴
۱-۹-۳٫ کودکان، نوجوانان و بزرگسالان. ۲۵
۱-۱۰٫ پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه . ۲۶
۱-۱۰-۱٫ پاسخ ایمنی همورال. ۲۷
۱-۱۰-۲٫ پاسخ ایمنی سلولی ۲۸
۱-۱۱٫ روش های آزمایشگاهی تشخیص. ۳۰
۱-۱۱-۱٫ کشت ۳۰
۱-۱۱-۲٫ سرولوژی. ۳۰
۱-۱۱-۳٫ PCR 32
۱-۱۲٫ مدیریت بیماری. ۳۳
۱-۱۳٫ پیشگیری ۳۴
۱-۱۳-۱٫ راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی ۳۵
۱-۱۳-۱-۱٫ واکسیناسیون بالغین و سالمندان. ۳۷
۱-۱۳-۱-۲٫ حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین ۳۷
۱-۱۳-۱-۳٫ ایمن سازی نوزادان و کودکان. ۳۸
۱-۱۳-۱-۴٫ واکسیناسیون مادر در دوران بارداری ۳۸
۱-۱۴٫ استراتژی های واکسن. ۳۹
۱-۱۴-۱٫ واکسن غیر سلولی سیاه سرفه. ۳۹
۱-۱۴-۲٫ واکسن سلولی سیاه سرفه ۴۰
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
۲-۱٫ تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه ۴۲
۲-۱-۱٫ تعریف تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) . 43
۲-۱-۲٫ تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) 44
۲-۱-۳٫ ابداع روش کشت. ۴۴
۲-۱-۴٫ جداسازی سلول باکتری از کشت ۴۵
۲-۲٫ تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی ۴۶
۲-۳٫ غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه. ۴۷
۲-۳-۱٫ استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه. ۴۷
۲-۳-۲٫ استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه. ۴۹
۲-۳-۳٫ استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه ۴۹
فصل سوم: مواد و روش ها
۳-۱٫ تجهیزات و وسایل ۵۱
۳-۲٫ مواد و محیط ها ۵۲
۳-۲-۱٫ محیط کشت آگار بورده ژانگو. ۵۲
۳-۲-۲٫ محیط کشت وِروِی ۵۳
۳-۲-۳٫ محیط B2 54
۳-۲-۴٫ محیط کشت سویابین کازئین ۵۴
۳-۲-۵٫ محیط تیوگلیکولات براث ۵۵
۳-۳٫ روش کار . ۵۶
۳-۳-۱٫ انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس. ۵۶
۳-۳-۱-۱٫ لیوفیلیزه کردن. ۵۶
۳-۳-۲٫ کشت باکتری سیاه سرفه ۵۶
۳-۳-۲-۱٫ کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو ۵۶
۳-۳-۲-۲٫ کشت بذر روی محیط وِروِی. ۵۷
۳-۳-۲-۳٫ مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه. ۵۷
۳-۳-۲-۳-۱٫ استریلیزاسیون فرمانتور ۵۷
۳-۳-۲-۳-۲٫ آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری. ۵۸
۳-۳-۲-۳-۳٫ تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور. ۵۸
۳-۳-۳٫ جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت. ۵۹
۳-۳-۳-۱٫ جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سانتریفوژ ۵۹
۳-۳-۳-۲٫ جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سیستم میکرو فیلتراسیون. ۵۹
۳-۳-۴٫ غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه. ۶۰
۳-۳-۵٫ سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه ۶۰
۳-۳-۵-۱٫ سمیت زدایی با بهره گرفتن از فرمالین. ۶۱
۳-۳-۵-۲٫ سمیت زدایی با بهره گرفتن از تیومرسال. ۶۱
۳-۳-۶٫ تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه. ۶۱
۳-۳-۶-۱٫ تست استریلیتی. ۶۱
۳-۳-۶-۲٫ تست کنترل غیرفعال بودن باکتری ۶۲
۳-۳-۶-۳٫ تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) . 62
۳-۳-۶-۴٫ تست توانمندی. ۶۲
فصل چهارم: نتایج
۴-۱٫ تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو. ۶۴
۴-۲٫ تهیه بذر در محیط وِروِی ۶۴
۴-۳٫ کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن ۶۴
۴-۴٫ جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت ۶۷
۴-۵٫ غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن. ۶۹
۴-۵-۱٫ سمیت زدایی با فرمالین. ۶۹
۴-۵-۲٫ سمیت زدایی با تیومرسال. ۶۹
۴-۶٫ آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه. ۶۹
۴-۷٫ نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه
سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال. ۷۲
۴-۸٫ آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها. ۷۵
۴-۹٫ تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه. ۸۰
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
بحث ۸۳
نتیجه گیری و پیشنهادات ۸۸
منابع ۸۹
خلاصه انگلیسی . ۹۷
ضمایم . ۹۸
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول۱-۱٫ آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه. ۹
جدول۱-۲٫ علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه. ۲۶
جدول۱-۳٫ آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن ۳۴
جدول۱-۴٫ واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف ۳۶
جدول۲-۱٫ ترکیب محیط لیستر و B2 بر اساس گرم در لیتر. ۴۵
جدول۳-۱٫ لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده ۵۱
جدول۳-۲٫ لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه. ۵۲
جدول۳-۳٫ ترکیبات محیط بورده ژانگو. ۵۳
جدول۳-۴٫ ترکیبات محیط کشت وِروِی. ۵۳
جدول۳-۵٫ ترکیبات محیط کشت B2 54
جدول۳-۶٫ ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین. ۵۵
جدول۴-۱٫ اطلاعات دوره کشت باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن. ۶۸
جدول۴-۲٫ نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین ۷۰
جدول۴-۳٫ نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با تیومرسال. ۷۱
جدول۴-۴٫ نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از آزمون MWG 73
جدول۴-۵٫ نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با بهره گرفتن از آزمون MWG ۷۶
جدول۴-۶٫ نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با بهره گرفتن از آزمون MWG 77
جدول۴-۷٫ نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) ۸۰
جدول۴-۸٫ نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV) ۸۱
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار۱-۱٫ مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال
۲۰۰۰ تا ۲۰۱۰ ۶
نمودار۴-۱٫ تغییرات pH کشت سویه ۱۳۴ از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور. ۶۵
نمودار۴-۲٫ تغییرات pH کشت سویه ۵۰۹ از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور. ۶۵
نمودار۴-۳٫ مقایسه میانگین جذب نوری در طول موج های۵۳۰ و۵۹۰ در مقدار جرم باکتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه ۱۳۴ و ۵۰۹ ۶۶
نمودار۴-۴٫ مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×۱) سویه ۱۳۴ در پایان دوره کشت در هنگام برداشت ۶۶
نمودار۴-۵٫ مقدا
ر غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×۱) سویه ۵۰۹ در پایان دوره کشت در هنگام برداشت ۶۷
نمودار۴-۶٫ مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه سویه ۱۳۴ توسط فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تست MWG . 74
نمودار۴-۷٫ مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه در سویه ۵۰۹ توسط فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تست MWG. 74
نمودار۴-۸٫ مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه ۱۳۴ ۷۸
نمودار۴-۹٫ مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین
نسبت به تیومرسال در سویه ۵۰۹ ۷۸
نمودار۴-۱۰٫ مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه ۱۳۴ با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه کنترل ۷۹
نمودار۴-۱۱٫ مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واکسن سیاه سرفه حاصل از سمیت
زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش۵۰۹ توسط تست MWG . 79
نمودار۴-۱۲٫ مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV 81
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل۱-۱٫ کوکوباسیل سیاه سرفه ۷
شکل۱-۲٫ اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی ۹
شکل۱-۳٫ شمای شماتیک از پرتوسیس توکسین ۱۱
شکل۳-۱٫ فرمانتور استفاده شده برای کشت سیاه سرفه. ۵۸
خلاصه فارسی
سیاه سرفه بیماری عفونی باکتریال دستگاه تنفس است که عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باکتری های گرم منفی می باشد. در این مطالعه شش بچ از سویه های ۱۳۴ و ۵۰۹ باکتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیکی سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باکتری از محیط کشت استفاده گردید. سپس سلولهای جداسازی شده باکتری درPBS خنک و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نامهای سوسپانسیون سمیتزدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD بعد از غیرفعال سازی در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد بمدت ۱۰ دقیقهmM ۱۰فرمالین (۷/۳۷ %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای ۸-۴ درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انکوبه شدند. در روزهای ۱۰، ۳۰، ۹۰، ۱۸۰ و ۲۷۰ از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واکسن آزمایشی FD وTD از مخلوط کردن غلظت های مشابه دو سویه ۱۳۴ و ۵۰۹ تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واکسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick ارزیابی نمود. نتایج حاکی از آن بود که روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره ۶/۲۶ روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره ۱۹۵ روز، روش کوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین ۹/۵ از واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین ۹۵/۵ قدری کاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با کاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت ۸-۴ درجه سانتیگراد بمیزان ۵/۷ برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واکسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود ۰۵/۰ واحد بیشتر از واکسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود.
کلیدواژهها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik
فصل اول
